جداسازی و شناسایی باکتری های مولد نیتریل هیدرولاز از فاضلاب شهر کرمان، ایران

نیتریل ها ترکیباتی سمی و بسیار خطرناک برای موجودات زنده می باشند که به طور گسترده توسط بشر تولید و موجب آلودگی محیط زیست می شوند. باکتری های مولد نیتریل هیدرولاز پتانسیل بالایی را در تبدیل زیستی ترکیبات نیتریل و تولید اسید ها و آمید های ارزشمند صنعتی نشان می دهند. در این تحقیق، برای غنی سازی و جداسازی باکتری های هیدرولیز کننده استونیتریل از محیط کشت اختصاصی حاوی 1 درصد استونیتریل به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن استفاده شد. فعالیت آنزیم و تولید آمونیاک در محیط کشت توسط روش فنل-هیپوکلریت سنجیده شد. باکتری های جدا شده توسط آزمون های بیوشیمیایی - میکروبی و مولکولی شناسایی گردیدند. بهینه سازی شرایط تولید آنزیم در حضور منابع مختلف کربن، نیتروژن وph بررسی و مقدار نیتریل و اسید حاصل توسط کروماتوگرافی گازی تعیین شد. در این پژوهش، دو سویه پسودوموناس آئروژینوزا fa2 و باسیلوس سرئوس fa12 با توانایی هیدرولیز کنندگی استونیتریل از فاضلاب شهر کرمان جداسازی و شناسایی شدند. نتایج نشان دادند که این دو سویه با هیدرولیز استونیتریل به ترتیب منجر به افزایش ph اولیه محیط از 7 به 37/9 و 40/9 شدند. در فرآیند بهینه سازی محیط تولید آنزیم، مشخص گردید که گلوکز (10گرم بر لیتر) و نشاسته (5 گرم بر لیتر) به عنوان منابع کربن و اوره (5 گرم بر لیتر) و عصاره مخمر (15 گرم بر لیتر) به عنوان منابع نیتروژن در مقایسه با کنترل، تولید آنزیم در سویه fa2 را افزایش می دهند. این درحالی است که در سویه fa12، تولید آنزیم و وزن خشک سلول به وسیله مقدار 10 گرم بر لیتر گلوکز و عصاره مخمر افزایش می یابد. نتایج نشان می دهد که تولید آنزیم fa2 در دامنه 7-5 ph افزایش و سپس کاهش می یابد. این روند افزایش در باکتری fa12 در دامنه 7-6 ph مشاهده شده است. در هر دوسویه افزودن منابع یونی مانند منیزیم، آهن و سدیم موجب افزایش تولید و منابع یونی کبالت و منگنز و مس موجب مهار تولید آنزیم شده است. وزن مولکولی نیتریلاز خالص fa2 و fa12 روی ژل sds page به ترتیب 38 و 45 کیلو دالتون به دست آمد. بررسی خصوصیات آنزیمی دو سویه نشان می دهد که نیتریلاز هر دو سویه فعالیت و پایداری بالایی در 7 ph و دمای 40 درجه سانتی گراد دارد. با وجود مهار 60 درصدی فعالیت نیتریلاز سویه fa2 در حضور منابع یونی منگنز و مس، این سویه در حضور منابع یونی کبالت و کلسیم به طور کامل فعالیت نیتریلازی خود را از دست داده است. مهار فعالیت نیتریلازی سویه fa12 در حضور dtt به میزان 80 درصد به دست آمد. مقادیر km نیتریلاز سویه fa2 در حضور سوبسترای استونیتریل و استآمید به ترتیب 92/6 و 56/1 به دست آمد که این مقادیر برای سویه fa12 88/5 و 68/1 مشاهده گردید. منحنی میزان آمونیاک آزاد شده از هیدرولیز دو سوبسترای استونیتریل و آکریلونیتریل به وسیله سویه fa2 بر حسب زمان رسم گردید. این منحنی بالاترین میزان آمونیاک تولیدی برای استونیتریل در زمان 5 ساعت و برای آکریلونیتریل در زمان 5/7 ساعت را نشان می دهد. درصد هیدرولیز استونیتریل و آکریلونیتریل به وسیله سویه fa2 با روش کروماتوگرافی گازی نیز سنجیده شد. این نتایج نشان می دهد این سویه ها با توانایی کاربردی در تبدیل زیستی ترکیبات نیتریل به مواد ارزشمند، می توانند در رفع آلودگی های زیست محیطی نیز استفاده شوند.